На основании только клинических данных бывает трудно дифференцировать вирусный гепатит и другие заболевания печени (особенно механическую желтуху). Поражение печени сопровождается повышением активности сывороточных ферментов. Мы установили, что наиболее информативными являются уровни ГОТ и ГПТ, а также коэффициент ГОТ/ГПТ. Для вирусного гепатита характерно увеличение активности обоих ферментов и снижение коэффициента ГОТ/ГПТ, который в норме превышает1.
При механической желтухе повышение активности аминотрансфераз может напоминать таковое при вирусном гепатите, однако эти состояния можно дифференцировать на основании определения уровней ферментов в динамике. Для подтверждения обструкции желчных путей можно определять уровни других ферментов, таких как щелочная фосфатаза и лейциламинопептидаза. Осадочные пробы и электрофорез белков плазмы имеют ограниченное значение в диагностике острого вирусного гепатита, однако они могут быть использованы для оценки активности заболевания и его прогрессирования с развитием хронического активного гепатита и цирроза. Функциональные печеночные пробы (нагрузочные) или определение сывороточного железа не позволяют подтвердить диагноз вирусного гепатита. Анализ сывороточного билирубина и различных фракций билирубина в крови также не имеют дифференциально-диагностического значения за исключением очень редких случаев. По этим причинам более важное значение имеют две группы диагностических тестов: (а) изменения уровни белков плазмы, которые часто отмечаются при вирусном гепатите; (б) повышение активности некоторых сывороточных ферментов.
Вирусный гепатит и изменения уровней белков плазмы
Гипергаммаглобулинемия При остром вирусном гепатите с обратимым поражением печени отмечают умеренное снижение уров- ней альбумина в плазме и увеличение содержания b- и g-гаммаглобулинов, в то время как при остром необратимом поражении печени (острая атрофия) снижение концентрации альбумина сопровождается снижением уровней a- и b-глобулинов и увеличением концентрации g-глобулинов. При механической желтухе наблюдаются иные изменения уровней сывороточных белков – увеличение содержания a- и b-глобулинов при нормальной концентрации g-глобулинов. Подобные изменения отмечаются, если механическая желтуха развилась недавно, в то время как при персистировании желтухи появляются признаки функционального поражения печени, которые позволяют предсказать развитие билиарного цирроза (Viollier, 1957). Соответственно, гипергаммаглобулинемия свидетельствует в пользу диагноза гепатита только при кратковременном сохранении желтухи. Нормальный уровень g-глобулинов в таких случаях указывает на обструкцию желчных путей. Однако результаты электрофореза белков сыворотки не специфичны и имеют небольшое практическое значение при дифференциальной диагностике вирусного гепатита и механической желтухи. Осадочные пробы В прошлом осадочные пробы широко использовали для диагностики безжелтушного гепатита, а также хронического активного гепатита и цирроза печени. Однако этот метод имеет существенные ограничения, такие как субъективность, недостаточная точность и вариабельность результатов тестов, выполненных в различных лабораториях. Техническое совершенствование метода с целью повышения чувствительности, специфичности и воспроизводимости неизбежно приведет к его усложнению. При интерпретации результатов осадочных проб следует учитывать их неспецифичность. Например, при персистировании желтухи и развитии поражения печени осадочные пробы становятся положительными, как при остром или подостром вирусном гепатите. Кроме того, у значительного числа пациентов с желтушным и безжелтушным вирусным гепатитом осадочные пробы отрицательные. Применение осадочных проб в сочетании с ферментативным тестами не приводит к значительному повышению точности диагностики, однако результаты проб могут быть полезными индикаторами активности и прогрессирующего течения гепатита.
Тест Jirgl С помощью этого теста определяют фракции плазмы, которые растворимы в сульфосалициловой кислоте и не растворимы в фосфорновольфрамовой кислоте. Положительный результат пробы указывает на механическую желтуху. Однако результаты исследования оказываются ложноположительными в 25% случаев и ложноотрицательными в 10%. Результаты теста имеют ограниченное диагностическое значение (Jirgl, 1957; Coltorti et al., 1963). В течение последних нескольких лет при вирусном гепатите было установлено важное диагностическое значение повышения сывороточной активности различных ферментов, которая практически всегда нормальная у здоровых людей (De Ritis et al., 1955a, b). Первый вопрос, который сразу возникает: насколько специфичны эти ферменты с этиологической точки зрения. Ответ на этот вопрос отрицательный. Характер биохимических изменений плазмы при поражения печени (от дистрофии до некроза) зависит не от его этиологии, а от типа поражения. При гепатите преобладают некротические изменения печени, а сходное выделение ферментов в кровь происходит при некрозе невирусного прохождения (ишемическом, токсическом). Второй вопрос – специфично ли повышение активности ферментов для заболевания печени.
В идеале было бы желательным определять в плазме активность ферментов, которые содержатся только в клетках печени. Некоторые ферменты соответствуют этому требованию, однако они не имеют существенного диагностического значения. С другой стороны, определенные ферменты не обладают абсолютной органоспецифичностью, тем не менее, их активность претерпевает характерные изменения при вирусном гепатите. Сывороточные аминотрансферазы Этот тест был предложен De Ritis, Coltorti & Giusti (1955a, b) в 1955 году. В последующем те же авторы подтвердили его важность в диагностике вирусного гепатита (De Ritis, Coltorti & Giusti, 1956a,b; 1957; 1961; De Ritis, Ascione et al., 1959). Восьмилетний опыт применения и изучения роли сывороточных аминотрансфераз позволяет сделать следующие выводы: (1) При остром вирусном гепатите отмечается значительное увеличение активности ГОТ и ГПТ, которое иногда достигает 2000-4000% и редко не превышает 1000%.
Для гепатита характерно увеличение как ГОТ, так и ГПТ (до 40 норм). Активность ГПТ увеличивается в большей степени, поэтому коэффициент ГОТ/ГПТ снижается менее 1 (в норме он превышает этот показатель). (2) Сходные изменения наблюдаются при безжелтушном гепатите (соответственно, этот диагноз легко установить на основании анализа активности аминотрансфераз). (3) Повышение активности аминотрансфераз предшествует развитию желтухи и положительным результатам осадочных проб. Следует отметить, что при биопсии печени у пациентов с высокой активностью аминотрансфераз, но без желтухи обнаруживали типичные признаки активного гепатита. У таких больных желтуха может появиться только через 20-30 дней (Tolentino et al., 1957; Delkeskamp et al., 1959). (4) Активность аминотрансфераз не зависит от степени гипербилирубинемии, сывороточных уровней белков и результатов осадочных проб. (5) При вирусном гепатите активность аминотрансфераз вариабельная, что отражает течение болезни печени. (6) В период выздоровления абсолютные уровни аминотрансфераз нормализуются, однако коэффициент ГОТ/ГПТ остается низким в течение одной или нескольких недель, что иногда позволяет установить диагноз вирусного гепатита ретроспективно. (7)
Снижение коэффициента ГОТ/ГПТ менее 1 не дает возможность установить диагноз вирусного гепатита, если уровни двух ферментов нормальные или повышены умеренно. При других заболевания печени (гепатите с бактеральным гепатохолангитом, циррозе, опухоли) и заболеваниях других органов не наблюдали сходных изменений активности аминотрансфераз за очень редкими исключениями (например, распространенное опухолевое поражение с тяжелым некрозом печени или амебный гепатит). В некоторых случаях внезапный стаз и ретроградный ток желчи при механической желтухе (природа обструкции не имеет значения) сопровождается повреждением гепатоцитов, которое может привести к развитию некроза. Соответственно, возможно повышение активности аминотрансфераз, напоминающее таковое при вирусном гепатите (обычно значительно более умеренное). В таких случаях дифференцировать механическую желтуху от вирусного гепатита позволяет повторное определение уровни аминотрансфераз в динамике, даже при отсутствии других клинических критериев или лабораторных данных, таких как повышение активности щелочной фосфатазы или гипер холестеринемия. При механической желтухе повышенная активность аминотрансфераз имеет тенденцию к снижению, а коэффициент ГОТ/ГПТ нормализуется, в то время как при вирусном гепатите он остается очень низким (0,5-0,6), а концентрации двух ферментов не снижаются или иногда еще больше повышаются. Применение этих критериев позволяло диагностировать вирусный гепатит даже у пациентов с холелитиазом, у которых одним из первых симптомов была боль в правом подреберье. Диагностическое значение сывороточных аминотрансфераз было подтверждено при обследовании 263 пациентов с желтухой (у 195 имелся вирусный гепатит, у 23 – бактериальный холангиолит, у 45 – холестатическая желтуха). В зависимости от активности ферментов 195 больных вирусным гепатитом были разделены на две группы – с резким и менее выраженным повышением сывороточных уровней ферментов. Пациенты этих групп были затем распределены на две подгруппы в зависимости от коэффициента ГОТ/ГПТ (0,70-0,99 или <0,70). Средние значения коэффициента ГОТ/ГПТ были значительно менее 1 в каждой группе. Низкие значения показателя позволяли легко установить диагноз у пациентов первой и второй групп (в 77% случаев), так как они всегда сочетались с высокими сывороточными уровнями аминотрансфераз. В третьей группе (20% от всей выборки) повышение активности аминотрансфераз было менее выраженным, однако диагноз подтверждался очень низким значением коэффициента (в среднем 0,49). Только в2,1% случаев диагностическое значение теста было низким, так как снижение коэффициента ГОТ/ГПТ (в среднем 0,82) сочеталось с небольшим увеличением сывороточной активности аминотрансфераз.
Сорок пять пациентов с механической желтухой были распределены на 4 группы. Первую группу (77,8% пациентов) составили больные с нормальной или незначительно повышенной активностью аминотрансфераз, у которых коэффициент ГОТ/ГПТ превышал 1. Во вторую группу (5,6%) были включены пациенты с незначительно повышенной активностью ферментов и значением коэффициента менее 1. У пациентов третьей группы умеренное повышение активности аминотрансфераз сопровождалось значением коэффициента ГОТ/ГПТ более 1. В этих трех группах отсутствие вирусного гепатита не вызывало сомнения. Установить диагноз было сложно только у пациентов четвертой группы (4,4%), у которых значительное повышение уровня аминотрансфераз сочеталось со снижением коэффициента менее 1. У всех пациентов с бактериальным холангиолитом активность аминотрансфераз была низкой, а коэффициент ГОТ/ГПТ приближался к 1. Соответственно, его было легко дифференцировать от вирусного гепатита, но не от механической желтухи. Одновременное определение уровней ГОТ и ГПТ и расчет коэффициента ГОТ/ГПТ позволяли диагностировать вирусный гепатит в 97% случаев и механическую желтуху в 95% случаев. У оставшихся пациентов с холестатистической желтухой важное диагностическое значение имеют результаты определения активности аминотрансфераз в динамике. Высокие исходные уровни ферментов быстро снижаются, в то время как концентрация билирубина остается высокой или даже увеличивается. Другие ферменты, использующиеся для диагностики некротического поражения печени Среди других ферментов, которые выделяются в плазму при вирусном гепатите, только немногие пригодны для диагностики некроза печени: фруктоза-1,6дисфосфат альдолаза, фосфогексоза изомераза, фосфогликомутаза, триозфосфат изомераза (Bruns & Puls, 1954; De Ritis, Giusti & Coltorti, 1957a,b; Giusti, 1962; Wolfson et al., 1958). Динамика уровней этих ферментов сходна: они быстро и значительно повышаются при вирусном гепатите (даже при безжелтушной форме) и не меняются или увеличиваются незначительно при желтухе, связанной с холестазом или другими заболеваниями печени. Выявление указанных изменений позволяет в большом числе случаев провести дифференциальный диагноз.
Сохранение повышенной активности ферментов после нормализации уровней билирубина и результатов печеночных проб указывает на персистирование активности заболевания печени. Гепатоспецифические ферменты Активность некоторых ферментов, содержащихся только в печени, значительно повышается в сыворотке при вирусном гепатите, в меньшей степени увеличивается при механической желтухе (фруктозо-фосфат альдолаза, орнитин-карбамил трансфераза, сорбитол дегидрогеназа) и не меняется при заболеваниях других органов (Wolf et al., 1957; Giusti et al., 1961; Reichard, 1957). Гепатоспецифичность этих ферментов является преимуществом только теоретически, так как повышение активности аминотрансфераз или фруктозо-1,6дисфосфат альдолазы, наблюдающееся при инфаркте миокарда или мышечной дистрофии, не представляет проблемы при диагностике заболеваний печени. Определение активности органоспецифических ферментов оправдано только в особых случаях, например, при диагностике вирусного гепатита (желтушного или безжелтушного) у пациентов с миодистрофией, у которых повышение активности аминотрансфераз или фруктозо-1,6-дисфосфат альдолазы может быть следствием поражения мышц. В остальных случаях определение активности подобных ферментов не рекомендуется, учитывая их низкую чувствительность и быстрое снижение даже в активную фазу заболевания. Ферменты, использующиеся для диагностики холестатистической желтухи Уровни некоторых ферментов информативны в диагностике механической желтухи (учитывая их значительное увеличение в плазме), а также вирусного гепатита. Хотя эти тесты не имеют реального значения при наличии типичных изменений активности аминотрансфераз, они могут быть полезными у небольшого числа пациентов с недостаточно характерными изменениями лабораторных показателей (например, небольшое увеличение уровней обеих аминотрансфераз, отрицательные осадочные пробы). В таких случаях трудно исключить механическую желтуху, особенно при наличии выраженной гипербилирубинемии и значительного обесцвечивания стула. В подобных ситуациях, которые встречаются исключительно редко, обнаруживают повышение активности ферментов, характерных для механической желтухи. К этим ферментам относятся следующие. (a) Щелочная фосфатаза. При механической желтухе значительно повышается активность щелочной фосфатазы, главным образом при полной и длительной обструкции (Bodansky, 1933; Roberts, 1930; Coltorti et al., 1963); уровень фермента увеличивается в значтельно меньшей степени при вирусном гепатите и не меняется при безжелтушной форме гепатита. (b) 5-нуклеотидаза. Изменения активности этого фермента сходны с таковыми щелочной фосфатазы, но менее специфичны, так как отмечаются при заболеваниях костей (Dixon & Purdom, 1954; Young, 1958). (c) Лейциламинопептидаза. Активность фермента также значительно увеличивается при механической желтухе, особенно при полной и длительной обструкции. При вирусном гепатите она увеличивается в значительно меньшей степени (Goldbarg & Rutenburg, 1958; Banks et al., 1960; Giusti & Piccinino, 1963). Определение фракций билирубина в крови практически не имеет диагностического значения.
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АМИНОТРАНСФЕРАЗ
Диагностика безжелтушного вирусного гепатита или преджелтушных стадий вирусного гепатита Определение сывороточной активности аминотрансфераз у пациентов, имевших контакт с больными вирусным гепатитом, позволяет диагностировать безжелтушную форму гепатита, а также установить диагноз на преджелтушной стадии. В некоторых выборках, особенно среди детей, доля пациентов с безжелтушным вирусным гепатитом значительно превышает долю больных с желтушной формой (3:1 – 30:1) (De Ritis, Mallucci et al., 1959; Giusti et al., 1959; Coltorti et al., 1961). Выявление безжелтушного гепатита позволяет также выделить носителей вируса, которые являются распространителями инфекции, особенно при субклинической форме заболевания. Диагностика вирусного гепатита у доноров крови Если у потенциального донора крови определяются умеренное повышение активности аминотрансфераз и стойкое снижение коэффициента ГОТ/ГПТ, следует предполагать диагноз гепатита. Такие пациенты не должны быть донорами крови. Подобные изменения активности ферментов сами по себе не позволяют судить о том, перенес ли пациент вирусный гепатит в анамнезе или страдает им в настоящее время. Ответить на этот вопрос позволяет определение активности ферментов в динамике. В последнем случае уровни аминотрансфераз увеличиваются, а коэффициент ГОТ/ГПТ снижается менее 1. Уровни аминотрансфераз необходимо обязательно определять у всех доноров. Оценка эффективности лечения вирусного гепатита Определение активности ГОТ и ГПТ в динамике каждые 4-5 дней у пациентов с желтухой может быть полезным для оценки эффективности медикаментозной терапии. Мы провели контролируемое исследование, в котором изучали эффективность преднизона у пациентов с вирусным гепатитом (De Ritis et al., 1964). Полученные результаты не достигли статистической значимости, хотя средние уровни аминотрансфераз и билирубина в группе преднизона были несколько ниже, чем в группе плацебо. Отсутствие статистической значимости объяснялось тем фактом, что преднизон у большого числа пациентов не оказывал никакого влияния на лабораторные показатели. С другой стороны, в группе плацебо у определенной части пациентов наблюдалось раннее спонтанное улучшение уровней ферментов, которое было сопоставимым с таковым у больных, ответивших на лечение прднизоном. Определение уровня аминотрансфераз при оценке активности перенесенного вирусного гепатита В большинстве случаев повышенные уровни аминотрансфераз нормализуются через 3-6 недель после появления желтухи, в то время как коэффициент ГОТ/ГПТ остается значительно сниженным (менее 1) в течение от одной до нескольких недель. Нормальный уровень аминотрансфераз в динамике у пациента, перенесшего желтушную форму гепатита, может расцениваться как признак выздоровления даже при сохранении коэффициента ГОТ/ГПТ менее 1, если параллельно улучшаются клинические проявления (нормализация размеров печени и селезенки, белкового состава крови и т.д.).
В других случаях не происходит плавного снижения активности аминотрансфераз, которая периодически повышается, что, возможно, отражает вспышки некроза печени. Эпизоды увеличения уровней ферментов, по нашему опыту, часто сопровождаются снижением коэффициента ГОТ/ГПТ, в то время как при снижении активности ферментов этот коэффициент увеличивается. У ограниченного числа пациентов несмотря на исчезновение желтухи и улучшение общего состояния уровни аминотрансфераз остаются высокими, а их отношение составляет менее 1. Подобные изменения могут сочетаться с диспротеинемией и положительными осадочными пробами, но могут и не сопровождаться другими лабораторными признаками активности заболевания. Повышение активности печеночных ферментов может предшествовать новым эпизодам желтухи (рецидивирующий гепатит). В других случаях сохраняющиеся биохимические изменения не сопровождаются рецидивами желтухи, однако печень постепенно увеличивается в размерах. При биопсии печениу пациентов с повышенными уровнями аминотрансфераз обнаруживали отчетливые признаки активного и прогрессирующего гепатита. В таких случаях часто отмечают хроническое течение гепатита и тенденцию к развитию цирроза. По нашему мнению, активность аминотрансфераз является наиболее надежным признаком активности гепатита. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Вирусный гепатит часто очень трудно дифференцировать от механической желтухи. Многочисленные исследования, проводившиеся в разных странах мира на протяжении последних 8 лет, позволили сделать вывод, что “трансаминазовый тест”, предложенный De Ritis, Coltorti & Giusti в 1955 году остается самым информативным, так как при вирусном гепатите наблюдаются характерные изменения активности ГОТ и ГПТ, позволяющие установить диагноз в 98% случаев. При остром вирусном гепатите их уровень иногда увеличивается на 2000-4000% (обычно не менее 1000%). При этом концентрация ГПТ увеличивается в большей степени, чем ГОТ, поэтому коэффициент ГОТ/ГПТ снижается менее 1.
Повышение уровней аминотрансфераз предшествует развитию желтухи и появлению положительных печеночных проб. При биопсии печени у пациентов без желтухи, но с высокой активностью аминотрансфераз обнаруживали типичные признаки активного гепатита. В таких случаях желтуха развивалась позднее – через 20-30 дней. Снижение коэффициента ГОТ/ГПТ менее 1 нельзя считать характерным для вирусного гепатита, если активность ферментов нормальная или повышена умеренно. Сходные изменения активности ферментов за очень редкими исключениями не наблюдаются при других заболеваниях печени. Иногда внезапный стаз желчи при недавно развившейся механической желтухе сопровождается повреждением гепатоцитов, которое приводит к их некрозу и изменению активности аминотрансфераз, характерному для вирусного гепатита. В таких случаях определение активности ферментов в динамике облегчает дифференциальный диагноз даже при отсутствии клинических критериев или других лабораторных изменений. В сомнительных случаях проводят дополнительные исследования: определение уровней щелочной фосфатазы и лейциламинопептидазы, осадочные пробы, электрофорез белков, измерение сывороточного уровня железа или СОЭ. Активность аминотрансфераз имеет важное значение для оценки активности подострого и хронического гепатита и эффективности лечения, а также для диагностики безжелтушного гепатита и носительства вируса среди доноров крови. Сохранение повышенных уровней аминотрансфераз в сочетании со снижением коэффициента ГОТ/ГПТ – это чувствительный показатель активности болезни.
Литература
Banks, B. M., Pineda, E. P., Goldbarg, J. A., Rutenburg, A. M. (1960) New Engl. J. Med., 263, 1277 Bessey, A. O., Lowry, 0. H. & Brock, M. J. (1946) J. bio. Chem., 164, 321Bodansky, О. (1933) J. bio. Chem., 101, 93 Bruns, F. & Puls, W. (1954) Klin. Wschr., 32, 656 Coltorti, M., Di Simone, A., Barbieri, A. M., del Vecchio Blanco, C. (1963) Policlinico, Sez. med., 70, 1596 Coltorti, M., Giusti, G. & Cirillo, C. (1961) Therapeutikon (Pisa), 1, 79 Delkeskamp, A., Schmidt, E. & Schmidt, F. W. (1959) Dtsch. med. Wschr., 84, 188 De Ritis, F., Ascione, A., Coltorti, M., Giusti, G. & Mallucci, L. (1959) Epatite virale, Relazione al If Congresso Internazionale di Patologia Infettiva della Societa Internazionale per lo studio delle Malattie Infettive e Parassitarie. Milano 6-10 Maggio 1959: G. Mal. infett., 11, Suppl. De Ritis, F., Coltorti, M. & Giusti, G. (1955a) Minerva Med., 1, 1207 De Ritis, F., Coltorti, M. & Giusti, G. (1955b) Boll. Soc. ital. Biol. sper., 31, 394 De Ritis, F., Coltorti, M. & Giusti, G. (1956a) Minerva Med., 1, 167 De Ritis, F., Coltorti, M. & Giusti, G. (1956b) Recenti Progr. Med., 20, 533 De Ritis, F., Coltorti, M. & Giusti, G. (1957) Clin. chim. Acta, 2, 70 De Ritis, F., Coltorti, M. & Giusti, G. (1961) In: Proceedings of the First European Symposium on Medical Enzymology, Milan, 1960, Basel, Karger, pp. 268-296 De Ritis, F., Giusti, G. & Coltorti, M. (1957a) Minerva Med., 1, 1958 De Ritis, F., Giusti, G. & Coltorti, M. (1957b) Experientia, 13, 81 De Ritis, F., Giusti, G., Mallucci, L. & Piazza, M. (1964) In: The Third International Congress of Infectious Pathology, Communications, Bucharest, 811 October 1962, Bucharest, Editura Academiei Republicii Populare Romine, pp. 423438 De Ritis, F., Mallucci, L., Coltorti, M. & Caldera, M. (1959) Bull. Wld Hlth Org., 20, 589 Dixon, F. & Purdom, M. (1954) J. clin. Path., 7, 351 Giusti, G. (1962) Boll. Soc. ital. Biol. sper., 38, 10 Giusti, G., Coltorti, M. & Cirillo, C. (1959) Mal. infett., 11, 106 Giusti, G., Di Simone, A. & Coltorti, M. (1961) Enzymologia, 23, 163 Giusti, G. & Piccinino, F. (1963) Acta hepatosplenol. (Stuttg.), 10, 166 Goldbarg, J. A. & Rutenburg, A. M. (1958) Cancer, 11, 283 International Union of Biochemistry (1961) Report of the Commission on Enzymes, London & New York, Pergamon Press, p. 45 Jirgl, V. (1957) Klin. Wschr., 35, 938 Reichard, H. (1957) Nord. Med., 58, 1016 Roberts, W. M. (1930) Brit. J. exp. Pat., 11, 90 Tolentino, P. & Rossi, M. (1957) G. Mal. infett., 9, 552 Viollier, G. (1957) In: Hartmann, F. W., Lo Grippo, G. A., Mateer, J. G. & Barron, J., Hepatitis frontiers, Boston, Little, Brown & Co., pp. 423-438 WHO Expert Committee on Hepatitis (1964) Wld Hlth Org. techn. Rep. Ser., 285, 18 Wolf, H. P., Forster, G. & Leuthard, F. (1957) Gastroenterologia, 87, 172 Wolfson, S. K., Spencer, J. A., Sterkel, R. L. & Williams-Ashman, H. G. (1958) Ann. N.Y. Acad. Sci., 75, 260 Young, J. J. (1958) Ann. N. Y. Acad. Sci., 75, 357